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访谈 | 刘龙奇:单细胞测序技术是生命科学发展的里程碑

2019-08-12

编者按


单细胞组学领域发展迅猛,备受关注,单细胞测序技术亦取得革命性突破。


本期,我们采访到刘龙奇博士,他是中国科学院生化与分子生物学专业博士,现任深圳华大生命科学研究院超级细胞研究所执行所长、单细胞战略项目负责人。同时担任西北大学兼职教授,郑州大学兼职副教授,华大基因学院高级讲师。他的研究方向为高通量单细胞多组学测序技术的研发和应用,在细胞命运转变,表观遗传学和基因表达调控,单细胞多组学等方面具有丰富的经验。近年来,他以第一或通讯作者在 Cell Stem Cell , Nature Materials , Nature Communications  等杂志上发表研究论文或评论多篇。


关于单细胞组学,他又有哪些见地与思考?





您能否简要介绍下这个领域发展历程和现状?

单细胞测序技术出现至今正好十年。如果说测序技术能用来“读”DNA和RNA,单细胞测序则是在测序技术的基础上结合单细胞建库技术来实现“读”每一个细胞。细胞是生命体结构和功能的组成单位,每个细胞可能都不同,细胞水平的“读”能帮助对细胞类型和状态进行精细分类,进而让人们充分理解细胞命运调控及人类疾病,是未来人类对细胞进行“改写”,实现生物智造及精准医疗的基础。


回顾历史,我们可以发现人们对于细胞认知的进步都来自一次次技术突破。17世纪,显微镜的发明让人们第一次真正看到了植物细胞,直到19世纪德国科学家创立了“细胞”学说,论证了生命体在结构上的统一性,推动了人们对细胞的结构与功能的研究。这以后诞生了一些重要的技术,比如“化学染料”的发明帮助人们辨识了不同类型细胞及内部的许多亚细胞结构。20世纪初,电子显微镜的发明将分辨率提高了5000倍,人们开始能够看清细胞内部的很多微小的结构,对细胞的功能的认知进一步提升,但即便如此人们对细胞的认识也还仅仅停留在形态和结构上。


17世纪,列文虎克透过磨制的显微镜首次看到了植物细胞


20世纪下半叶是分子生物学发展和成熟的黄金时期,人们对微观世界的探索不断加深,特别是围绕蛋白质和核酸分子的相关研究,人们意识到了分子水平对于细胞功能研究的重要性,因为从分子水平观察细胞,可以看到不同细胞之间的精细差别。


这也得益于一些里程碑技术的发明,如“免疫组化”技术特别是单克隆单体和流式细胞技术的问世,使得人们可以通过抗体-抗原的特异性结合观察细胞间蛋白表达的差异;“FISH”技术则是通过核酸分子的特异性杂交,捕捉细胞间DNA分布和RNA转录的细微差别。所有的技术都让大家可以更清晰地观察到特定的组织和器官的细胞组成和分布,如造血系统中的不同免疫细胞,大脑中的不同神经元类型等。


但是,以上技术只能分析1个或少数几个基因,通量受限。测序技术,特别是2007年左右短读长测序技术出现后,人们可以用很低的成本一次分析细胞里的全部基因序列或表达水平。 2009年,我国科学家汤富酬老师率先利用短读长测序技术实现了单个胚胎细胞的转录组测序,这是一次重要的尝试,开启了单细胞测序技术的先河。单细胞测序技术发展过程中有几个重要节点:


第一,早期大家做单细胞建库都是在单管中完成,即将细胞一个个分出来放在管中完成全部建库,本质上是优化了基于多细胞的方法,减少核酸损失,这种思路现在依然比较常用 ;


第二,2012年,有一款名为Fluidigm C1的单细胞建库仪器风靡业界,它首次将微流控技术和单细胞建库技术结合,实现了在纳升体系内完成单细胞建库,并且同时能完成96个单细胞建库。方案降低了单个细胞的建库成本,但仪器价格十分昂贵。现在来看,这款仪器寿命并不长,正在被新技术替代。



2015年出现了一个革命性的技术——基于液滴微流控的单细胞建库技术,实现了将细胞包裹在一个个很小的油包水的液滴(droplet)里面,液滴体积只有纳升级别,由于短时间内可以生产百万数量的液滴,使得单细胞建库的通量提高到了1000以上。该技术的出现使得单细胞大数据研究成为可能。与此同时,现在已经涌现了一批同等通量的单细胞技术,包括基于微孔芯片(microwell)以及组合分子标签(combinatorial indexing)的单细胞测序技术。



基于液滴微流控的单细胞建库技术



您如何看待单细胞测序技术的未来?


我认为从技术的角度来看,单细胞测序未来有几个非常重要的方向:


第一,生命体的细胞数量巨大,如正常人体的细胞数在1013级别,想全面理解生命未来需要进行生命体的单细胞大数据研究。而目前平台的建库通量还远远不够,根据目前技术发展的趋势,未来1-2年内通量有可能大幅提升,达到单次建库通量到十万甚至百万个细胞的级别。这将依赖于包括微流控,联合标签等在内的新技术发展。


第二,目前的高通量单细胞建库技术只能实现在一个细胞里拿到一个组学数据,未来能否做到同时获得多组学信息?单个组学能提供的信息还比较有限。多组学分析对于全面理解生命过程以及疾病发生至关重要。目前已经有很多单细胞多组学技术在单管中实现,如基因组/转录组,表观组/转录组,转录组/蛋白等同时测序技术。未来2-5年如何将这些技术实现高通量是需要解决的技术难题。


第三,不管从单细胞还是测序技术的角度来看,空间组学相关技术将会是未来最重要的技术之一。空间组学不仅能告诉我们序列和定量信息,还能直接告诉我们相应的位置信息。因为当我们去理解一个细胞的功能时,不仅要看细胞本身的形态,结构,分子特征,还应该看它跟其他细胞之间的关系以及它所处的微环境,这对进一步理解生命过程和疾病都会有重要的推动作用。目前空间组学技术还处于初级阶段,但是近几年基于FISH和测序技术的空间组学技术发展十分迅速,相信未来5-10年内实现超低成本和超高分辨率的组织的原位测序是有可能的。



单细胞测序技术的突破对于该领域的发展意味着什么?


单细胞技术的出现给领域带来突破是革命性的:


首先,单细胞技术的出现让测序技术从此进入了“高清”时代。过去,我们做测序是基于一群细胞去做的,得到的结果是所有细胞的平均结果。单细胞技术能辅助将测序信息分解到每个细胞中去,让我们获取到每个细胞的状态信息。人们不仅能全面理解同组织内不同细胞类型的分子特征,还能发现一些全新的细胞类型,特别是罕见却有重要功能的细胞。


其次,“高清”时代下,人们对生命系统和疾病的认知将显著提升。我们知道人体的细胞多种多样,然而过去已鉴定的人体细胞类型只有300多种,而单细胞测序技术出现以后,新鉴定的细胞类型数量激增,如光人视网膜组织的神经元现在已知有100多种。在这种高精度下,生命现象将变得异常清晰,相信过去的很多科学发现将会被极大丰富甚至改写。未来包括发育、再生、疾病、健康等研究都将从组织分辨率到单细胞分辨率的分子水平。这些研究对于理解生命系统、药物发现、疾病诊断和预防都将带来极大促进作用。


值得一提的是,高通量单细胞测序技术的出现,催生了一个重要的大科学项目——Human Cell Atlas(人类细胞图谱计划),这个项目由多国科学家共同参与,旨在利用最先进的单细胞组学技术,对人体细胞进行测序,构建人体的“google”地图。相信在单细胞大数据的驱动下,该项目将对人类健康事业产生深远的影响,与此同时该项目也将进一步推动技术的突破。



能否具体介绍下在您开展的项目中,MGISEQ平台在单细胞组学研究上有什么应用?有哪些特点?

非常有幸我是华大智造测序仪的最早一批用户,亲身经历和目睹了华大智造测序平台的测序性能和数据质量突飞猛进的提升过程。过去我们关注DNBSEQTM与市面同类平台质量的比较,而现在在测序质量已经与同行相当的情况下,我们还发现了DNBSEQTM更多的优势:



首先,DNA纳米球信号扩增具备先天优势,它采用滚环线性扩增原理,相比传统的指数扩增,避免了错误无限地放大,因此我们研究中发现MGISEQ的基因组比对率相比其他平台往往更高。部分同行也注意到了这一点,其中澳洲的科学家发表了文章直接指出了MGISEQ在针对单细胞的SNP calling的明显优势。MGI的准确性在今年的日本HCA闭门会议上也作为一个议题进行了讨论。同行们的认可确实让我们对MGISEQ具有很大的信心。



其次条码转移(Index switching)是同类平台可能存在的问题,该问题对于单细胞研究十分重要,因为我们通过条码来拆分单个细胞。当出现条码转移时,传统平台的指数扩增方法会把错误传递下去,而DNBSEQTM则能够有效避免。



最后,华大智造测序仪采用DNA纳米球微阵列芯片,排列规则,而非随机排布,芯片利用率高,成本自然有优势,相信这在未来单细胞大数据研究中将发挥重要的优势。



作为一名科研工作者,您对华大智造有什么期待?

华大智造做的是生命科技核心工具,是该领域最底层支撑的事业。它的出现和成长,对推动测序技术进步,打破行业垄断方面已经做出了重要的贡献。在这个发展速度极为迅速的领域,希望华大智造能时刻保持危机意识,面向未来,时刻为领域提供最先进的工具,成为推动生命科学和医学领域进步的领头羊。



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