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RNA系列产品 | MGIEasy RNA方向性文库制备,让基因表达分析更精准

2019-05-15

RNA是生物学分子机理研究中不可避免需要使用到的研究对象。细胞内的RNA蕴含着丰富的信息,包括序列、丰度、结构等。由于RNA表达具有时间和空间的特异性,样本获取难度较大,取材后样本中RNA的精准分析显得尤其重要。华大智造目前已发布四款基于MGI测序平台的RNA建库试剂盒,本次将重点介绍MGIEasy RNA方向性文库制备试剂盒。


目前主要的RNA研究策略包括转录组测序(mRNA),长链非编码RNA测序(lncRNA),小RNA测序(small RNA)和环状RNA测序(circRNA)等。华大智造已发布四款基于DNBSEQTM技术并与MGI测序平台适配的RNA建库试剂盒(表1)用于实现RNA的系统化研究。



前期我们已介绍了MGIEasy RNA文库制备试剂盒(可点击此链接或文末链接查看)[刘致恒(zhihe1] ,本期着重介绍MGIEasy RNA方向性文库制备试剂盒。对比常规RNA分析,方向性RNA测序分析在构建测序文库时,将RNA链的方向信息保存到文库中,测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链,这一方法更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构,同时可以发现反义转录本以及更多新的基因,是研究基因结构和基因表达调控的重要手段。简单的说,RNA方向性转录组测序就是高阶版本转录组测序,能够帮助生物狗更加精准分析基因转录表达信息。


那么MGIEasyRNA方向性文库制备试剂套装的表现究竟如何呢?让我们一一道来。


1.起始量可低至10ng

图1(左) 不同起始量PCR产量     图2(中) 不同起始量比对率     图3(右) 不同起始量基因检出数


用商业化标准品UHRR(Universal Human Reference RNA,Agilent,740000)进行测试,total RNA投入量分别为10ng,50ng,200ng和1μg,OligodT磁珠钓取polyA RNA后,采用MGIEasy RNA方向性文库制备试剂套装建库,结果显示,文库产量与1ug达到同等水平,基因比对率达到60%左右和基因检出数接近20000个,不同起始量不存在显著差异。即使当投入量低至10ng时,本试剂盒保持稳定高质量数据产出,能够解决生物狗珍贵样本分析的老大难问题,使得即使只有10ng total RNA的珍贵样本也依然可以保持高质量数据产出。


2. 基因表达定量精准,重复性好

同样是UHRR钓取polyA RNA后,采用MGIEasy RNA方向性文库制备试剂套装构建库,结果分析显示,在基因定量准确性上,MGIEasy RNA方向性文库与qPCR的一致性为0.86,与MGIEasy RNA文库(采用MGIEasy RNA文库制备试剂套装建库)的定量一致性达0.99以上,三次样本测试重复性可达到0.99以上。


图4(左) MGIEasy RNA方向性试剂盒与qPCR定量一致性  图5( 右)MGIEasy RNA方向性文库与MGIEasy RNA文库定量一致性


3. RNA结构分析更直接可靠

MGIEasyRNA方向性文库制备套装在结构分析上到底有哪些优势呢?首先是能准确定向RNA转录的方向,如图6所示,MGIEasyRNA方向性文库检测到正链的比例可以达99%。

图6 RNA方向性试剂盒与RNA试剂盒的正链比例


由于MGIEasy RNA方向性文库能够定位RNA转录的方向,所以在相同Reads深度的覆盖下,MGIEasy RNA方向性文库能更准确的确定Junction形成的位点,对于转录本结构检测及变异分析更有助益。

图7 RNA方向性试剂盒相比RNA试剂盒进行转录本结构检测的优势


4. 更完美的基因覆盖度

与I平台的同类型主流试剂盒的文库数据相比,MGIEasy RNA方向性文库具有更完美的基因覆盖度,能均匀覆盖基因5’端到3’端(图8),那么在转录本组装等方面就具有更多优势。RNA方向性试剂盒不仅在结构分析和基因表达定量分析上的双重优势,而且让基因检测更准确。


图8 RNA方向性试剂盒与I平台的主流试剂盒的均一性比较


RNA方向性试剂盒在基因结构分析和基因表达定量分析上的双重优势,让基因检测更准确。


当然,我们也不能只看MGISEQ平台上比较数据,为了分析不同测序平台之间是否存在显著性差异,我们也进行了I平台的主流试剂盒(N和K)数据一致性分析,结果显示与N试剂盒的一致性为0.95,与K试剂盒的一致性为0.98(图9)。整体上来说平台之间,不同试剂盒之间具有可比性。

图9 RNA方向性试剂盒与I平台的主流试剂盒的一致性


下面快速总结一下华大智造不同试剂盒以及使用范围,提供给各位生物狗们选择,让大家不要为了宝贵样本数据产出发愁。



以上试剂盒中,rRNA去除试剂盒是一款高效的RNA富集试剂盒,能有效去除rRNA,保留mRNA,lncRNA和circRNA。另外一种常见的RNA富集方法,是通过OligodT磁珠钓取具有polyA尾巴的mRNA和部分lncRNA,这种方法已有很多成熟的商用试剂盒。Total RNA样本经上述任一种富集方法处理后,即可结合MGIEasyRNA文库制备试剂盒套装或MGIEasy RNA方向性文库制备试剂盒套装进行文库构建并进行后续测序。


此外,关于small RNA文库制备试剂盒介绍请点击这里,这个可是华大智造测序平台上的王牌应用之一,在超过100篇文章中已经被验证和使用。


最后,奉上MGIEasy RNA方向性文库制备试剂盒实际数据供测评练手,请戳这里→

ftp://ftp.cngb.org/pub/CNSA/CNP0000288/CNS0040524/CNX0048125/CNR0066420/

ftp://ftp.cngb.org/pub/CNSA/CNP0000288/CNS0040524/CNX0048127/CNR0066422/


参考文献:

[1] Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., & Pandolfi, P. P.(2011). A ceRNA Hypothesis: The Rosetta Stone of a Hidden RNA Language?Cell, 146(3), 353–358.

[2] Kallen A N, Zhou X B, Xu J, et al. The imprinted H19 lncRNAantagonizes let-7 microRNAs[J]. Molecular cell, 2013, 52(1): 101-112.

[3] Jin X, Feng C, Xiang Z, et al. CircRNA expressionpattern and circRNA-miRNA-mRNA network in the pathogenesis of nonalcoholicsteatohepatitis[J]. Oncotarget, 2016, 7(41): 66455.


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