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文献解读 | 以创新测序技术的名义,透视外来入侵物种

2019-06-28

一百多年以前,草地贪夜蛾在大洋彼岸的美国扎根,它在当地造成了包括玉米在内的大量农作物的减产。草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda),又名草地夜蛾或伪黏虫,英文称为 fall armyworm(FAW),原来分布在南纬36度左右以南的大部分地区,包括阿根廷、巴西、智利、哥伦比亚、墨西哥、美国的德州及佛罗里达州等地方。


它无法在寒冷的冬季生存,却有非常强大的长途飞行能力,一个晚上就可以飞行100公里。每年春天,它会迁徙2000公里到达更北的地方,甚至到达加拿大。2016年,它迁徙到了非洲,慢慢遍布整个非洲地区,继而多个亚洲国家被入侵。2018年,研究者Early, R. 等曾预言中国将是下一个被草地贪夜蛾入侵的国家。


2019年的1月,草地贪夜蛾首次在云南被发现。没想到短短5个月后,中国18个省份均发现了它们充满破坏力的身影。由于在中国境内没有天敌的缘故,造成了大面积的农作物减产,引发巨额经济损失。为了尽快找到有效的防治方法,了解它的基因组信息和遗传背景显得迫切而重要。


深圳华大生命科学研究院联合多家单位的研究者们使用新一代长片段建库技术 stLFR (single tube long fragment reads)  [1] 高精度基因组解析方法,结合华大智造高通量基因测序仪MGISEQ-2000和Hi-C获得了来自云南省的一公一母两只草地贪夜蛾的染色体级别的基因组图谱。


 图1 草地夜蛾在世界范围内的分布情况


研究者们组装获得了2只草地贪夜蛾的基因组数据,公蛾的基因组大小为542.42Mb,Scaffold N50达到14.16Mb;母蛾的基因组大小是530.77Mb,Scaffold N50达到14.89Mb。研究者们预测公蛾有22,201个基因,而且他们发现与强化解毒和农药耐受性相关的基因家族 cytochrome P450和 glutathione s-transferase 在公蛾中均呈现扩张趋势。他们也发现在中国境内的草地贪夜蛾(2只来自云南,2只来自于广东)中有3只属于玉米寄生种(C Strain), 1只属于水稻寄生种(R Strain)。这预示着入侵中国的草地夜蛾可能来自于非洲,从历史因素看,这可能和中国与非洲的广泛经贸往来有很大联系。

 

草地贪夜蛾有很多宿主,包括42个属的186种植物,但是它更倾向于寄生在禾本科植物上,例如玉米、水稻等农作物。玉米和水稻对人类而言是非常重要的农作物,如果不对草地贪夜蛾进行控制,它将造成玉米40%-72%的减产,在某些地区甚至会造成高达100%的减产。仅在巴西,草地贪夜蛾一年就能造成6亿美元的经济损失。这充分说明草地贪夜蛾作为世界范围内的重大农作物害虫,急需有效的防治手段。

 

草地贪夜蛾至少有2个亚种,包括玉米寄生种(C Strain)和水稻寄生种(R Strain),C Strain 又分为两种类型,FL-type和TX-type。在美洲的主要是TX-Type,而FL-Type只生活在美国的佛罗里达州和加勒比海地区。每一个亚种均有不同的生理性状,会对某一些特定的生物或化学药剂敏感。例如,C Strain 比 R Strain 更能抵抗甲基对硫磷、氯氰菊酯、氯氰菊酯和?-内毒素以及转基因的苏云金芽孢杆菌毒素。因此,为了更好地防治草地贪夜蛾,首先要分析入侵中国的是哪些亚种,目前常规的方法是使用COI 和Tpi这两个基因来判断亚种属性。

 

获取更精确的草地夜蛾的基因信息将更有利于该物种的防治,寻找更多的新基因也将有利于苏云金芽孢杆菌转基因菌株的有效筛选以获得更有效的杀虫剂。目前已有一些草地贪夜蛾的基因组组装结果,但已有的组装结果都是碎片化的,这些数据不足以给防治工作提供精确的指导。

 

华大的研究者们提取了2只(1公1母,图2,表1)中国云南省的草地夜蛾的高质量的DNA,使用华大智造的MGIEasy stLFR Library Prep Kit (lot number: 1000005622) 构建文库,用高通量测序平台 MGISEQ-2000 分别获得了110.93Gb和91.44Gb的高质量数据。公蛾的组装结果显示,其基因组大小为542Mb,Contig N50 91.97Kb,Scaffold N50 507.12Kb。母蛾的组装结果显示,其基因组大小为530Mb,Contig N50 83Kb,Scaffold N50 528Kb。 接着使用了1个样本进行了 Hi-C 测序(表2),将该物种的基因组组装到了染色体级别 ,最终获得了31个染色体的完整组装结果,公蛾和母蛾的组装的 Scaffold N50分别达到了14.16 Mb和14.89 Mb。


这是首次使用单一个体的DNA进行草地夜蛾的基因组的组装。也是首次获得该物种的染色体级别的基因组,能获得如此高精度的草地夜蛾基因组要归功于stLFR这一新技术和超高的测序深度及高质量的测序数据。


图2 两个用作基因组组装的个体,左侧是母蛾,右侧是公蛾


表1 用于研究的样本信息


表2 两只草地夜蛾的组装结果


通过对2只广东采集的草地贪夜蛾的5龄幼虫和6龄幼虫的 RNA-SEQ 检测和 WGS检测,研究者们预测草地贪夜蛾有22,201个基因,通过与相关数据库进行比对,最终确定的基因中有94.2%与 BUSCO genes 数据库一致,95.16%与 CEGMA genes数据库一致。在这些确认的基因中,有93.48%的基因有功能。再通过转录本的组装分析,研究者们获得了51,495 个独立基因(Unigene),通过比较5龄幼虫和6龄幼虫,发现了这两种幼虫中有2,648个不同的基因表达。通过进一步的分析,发现这两只幼虫分别属于不同的亚种。接着通过使用9个物种,包括2,001个单基因拷贝绘制进化树,研究者们发现草地贪夜蛾(S. frugiperda)与 S. litura 比较接近(图3,表3)。glutathiones-transferase 基因家族的扩张被证明会导致S. litura更具有耐药性草地贪夜蛾的glutathiones-transferase 基因家族在结果中显示是有扩张趋势,因此草地贪夜蛾具有耐药性。


图3  9个物种进化树


表3  9个物种已经确认的基因信息


在云南采集的两只草地贪夜蛾均为C Strain,而在广东采集的2只中1只为 C strain,一只为 R Strain(图4,根据基因型进行判断,特别是E4)。而西半球的草地贪夜蛾都是 C Strain 的,这预示着在广东的草地贪夜蛾可能来自于非洲。因为广东地区广泛存在与非洲国家的商贸往来。当然,要搞清楚入侵中国的草地贪夜蛾来自于哪个地方需要进行更大量的样本采集和基因检测。


图4 C和R Strain 的鉴定


借助目前先进的长片段建库技术和准确、高效的基因测序平台,为草地贪夜蛾的基因组及遗传信息研究,获取高精度的草地贪夜蛾基因组提供了坚实的技术支撑和平台保障,也为防治草地贪夜蛾这一危害极大的外来物种起到至关重要的作用[2]


参考文献:

[1] Wang O, Chin R, Cheng X, et al. Efficient and unique co-barcoding of second-generation sequencing reads from long DNA molecules enabling cost effective and accurate sequencing, haplotyping, and de novo assembly[J]. Genome research, 2019: gr. 245126.118.

[2] Huan Liu, Tianming Lan, Dongming Fang, et al. Chromosome level draft genomes ofthe fall armyworm, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), an alieninvasive pest in China doi: https://doi.org/10.1101/671560




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