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碱基识别,我要无损的 | 华大智造CoolMPS高通量测序试剂套装圣诞开售

时间:2019-12-12作者:华大智造阅读数:18344分享

利用荧光标记方法通过DNA点阵成像获取碱基信号,是高通量测序技术的关键步骤之一。华大智造近期重磅发布的CoolMPS高通量测序试剂套装却颠覆过往,开创性地推出了基于抗体的测序试剂产品,它使用的dNTPs 未在碱基上标记荧光。这一创新,可以实现无损碱基识别,能够让碱基识别更为清晰。这一测序试剂套装也即将于圣诞节正式开售。

那么,它的诞生将带来哪些独具一格优势? 它的数据表现如何?

一、优势特点:信号强、天然、效率高

信号强、天然及效率高可以概括地反映CoolMPS高通量测序试剂盒的特点及优势:

首先,它信号强,每个抗体能标记多个荧光,碱基信号更强。每个抗体分子可以标记上多个荧光分子,相同拷贝数的DNB,用CoolMPS可以获得更高的信号和更高的信噪比,从而使测序更准确。图1显示了在多个循环中使用两种测序化学的强度比较,CoolMPS产品信号强度远高于传统高通量测序试剂产品。



1 测序时CoolMPS的信号强度及随循环数的变化趋势

其次,它没有非天然碱基带来的荧光淬灭,因为荧光分子标记在抗体上,测序过程中无多余化学键的残留。在传统的高通量测序方法中,聚合的碱基上会留下多余的化学键,即“疤痕”(图2),这可能会影响待测碱基上的荧光信号,进而影响测序的准确性。CoolMPS方法中新合成链的碱基为天然碱基,不会因为碱基上的疤痕而影响荧光信号,最终获得更高的准确性和更长的测序读长。

3展示了CoolMPS测序中,前两个碱基对被测碱基信号的影响。碱基上不存在任何疤痕,不论前面两个碱基是什么,其ACGT的信号均相当稳定。

4展示了CoolMPS的测序错误类型与前一个碱基的关系:无论前一个碱基是什么,CoolMPS的测序错误都非常低,且没有明显的错误偏好。

2 CoolMPS与传统高通量测序方法的比较:无疤痕

3 CoolMPS测序中,前两个碱基对被测碱基信号的影响

4 CoolMPSStandardMPS的比较:前两个碱基对被测碱基信号的影响

再者,它的反应更完全,即DNA聚合天然碱基的效率更高。聚合酶结合及新加的都是天然碱基, DNA聚合酶在生物体内的底物是天然dNTPs。 虽然经过突变体的改造,DNA聚合酶也能加碱基上有庞大荧光基团标记的dNTPs,但其反应效率远远不如加碱基上没有标记的dNTPs。此外每一轮反应接近100%的完成率也是进行长读长测序的必要条件,否则信号会呈现指数下降,产生测序错误。

测序时,常用lagrun on指标来反映反应是否完全。lag是指测序进行到N位置时,其某些拷贝才反应到N-1位置的比例;而runon则指某些拷贝已反应到N+1位置上的比例。我们测定了用于CoolMPS的测序酶在加100%的有荧光标记碱基的dNTPs与加无修饰碱基的cold dNTPslagrunon,其结果如图5所示,加cold dNTPs的平均lag值(0.2%)比加荧光标记dNTPs的平均lag值(0.7%)低很多。同时,加cold dNTPs的平均runon值(0.06%)比加荧光标记dNTPs的平均Runon值(0.24%)低很多。CoolMPS技术的低lag及低runon可能使得测序读长更长。

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5 DNA聚合酶对Cold dNTPLabeled dNTPs的聚合的lagrunon的效率比较

应用数据展示

1. CoolMPS PE100测序数据产量及Q30表现优异

CoolMPSStandardMPSPE100测序在WGS(PCR)WGS(PCR-Free)WESRNA-SeqPanel等应用上的数据显示:CoolMPS的数据产量比StandardMPS6%,且Q30%StandardMPS1~9%

7 CoolMPS PE100数据产量和数据质量表现(Demo数据)

2. 应用数据表现:外显子、肿瘤PanelRNA-Seq

针对三种不同的应用数据,结果显示CoolMPS测序数据的clean ratemapping rate表现良好,且覆盖度均一;CoolMPS检测频率准确,且与理论频率的相关性更高。

-外显子

样本:NA12878

建库:MGIEasy 外显子捕获V5探针试剂套装

测序平台:MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

测序读长:PE100CoolMPS PE100试剂)

测序结果:

4NA12878样本的WES数据截取100X平均深度的数据,采用MegaBolt软件进行了同步分析比较,如表2和图10所示,CoolMPS测序数据的clean ratemapping rate表现良好,且覆盖度均一。

2 CoolMPSWES分析结果

Sample

WES-NA12878

Insert-size

258bp

Average depth

102X

Rate-clean

98.22%

Q20-clean

96.24%

Q30-clean

88.31%

Mapping Rate

98.55%

Duplication Rate

12.24%

Capture Rate on Reads

63.75%

Uniformity(>0.2f

94.51%

8 CoolMPSStandardMPSWES数据比较

-肿瘤:

样本:FFPE标准品Horizon HD200

测序平台:MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

测序读长:PE100

测序试剂:CoolMPS & StandardMPS

测序结果:

CoolMPSStandardMPS检测频率均准确,CoolMPS检测与理论频率的相关性更高。

3 CoolMPSStandardMPS的肿瘤数据比较

Metrics

CoolMPS

StandardMPS

Clean Q30

92.1%

87.2%

Mapping rate

99.88%

99.95%

Capture rate

97.1%

97.3%

Coverage(>=100X)

99.4%

99.7%

Uniformity(>0.2x)

97.2%

95.4%


图9 CoolMPS与StandardMPS的肿瘤数据比较


10-1 StandardMPS与理论的突变检测频率的的相关性


10-2 CoolMPS与理论的突变检测频率的的相关性

-RNA-Seq

样本:UHRR标准品

建库:MGIEasy RNA方向性文库制备试剂套装

测序平台:MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

测序读长:PE100

测序试剂:CoolMPS & StandardMPS

sample

Total Clean Bases (Gb)

Total Genome   Mapping Ratio (%)

Total Gene Number

Total Transcript Number

CoolMPS

Lib1

8.3

96.3

19446

31038

Lib2

8.8

96.2

19456

31154

Lib3

10

96.2

19582

31496

Lib4

8.5

96.1

19433

31108

StandardMPS

Lib1

8.5

95.8

19495

31325

Lib2

8.4

95.6

19489

31180

Lib3

9

95.6

19517

31302

Lib4

8.8

95.4

19479

31244

11 CoolMPSStandardMPSN 平台与qPCR的相关性

CoolMPSStandardMPSN 平台与qPCR的相关性,Spearman r=0.866,高度一致。

12 CoolMPSStandardMPSN 平台的相关性

不同方法或相同方法测序重复性均大于0.99

三、 CoolMPS的测序原理

大家也许对CoolMPS的测序原理依然充满好奇,它实质上可以理解为联合探针锚定聚合技术(cPAS, Combinatorial Probe-Anchor Synthesis,或称为StandardMPS)的升级版,它使用的核苷酸是碱基上未标记荧光的dNTPscold dNTPs)。在DNA聚合酶的作用下,cold dNTPs被聚合到测序链,然后通过和与此cold dNTPs特异结合的荧光标记的抗体(图13)来实现碱基识别。再生后,抗体从测序链上掉落,测序链上新加入的碱基完全是天然的碱基,没有任何修饰,如此循环往复,完成对DNA的测序(图14)。

13 CoolMPS测序原理

14 CoolMPS测序时,抗体分子与碱基的结合

    拥有如此多优点的CoolMPS 高通量测序试剂套装将于今年圣诞节1225日正式开售,欢迎您一同探索它的奇妙与不凡!