基因测序

CN
您现在的位置: 首页 /  资讯

一文盘点华大智造新冠病毒检测方案

时间:2020-03-09作者:华大智造阅读数:645分享

近日,国家卫健委发布《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》。新版诊疗方案主要调整了以下内容:防疫形势提示警惕境外输入病例;传播途径增加“应注意粪便及尿对环境污染造成气溶胶或接触传播”;增加对孕产妇和儿童的临床表现描述;增加疑似病例排除标准……其中,诊断标准在已有的两种实验室检测方法(RT-PCR核酸检测和病毒基因测序)的基础上,新增“血清新型冠状病毒特异性lgM和lgG抗体作为病原学诊断标准之一”。


关于指南中提出的这几种方法,它们之间到底有怎样的差异,在实际应用中需要哪些工具和平台才能够顺利展开检测呢?我们一起来了解:


探究新冠病毒检测方法


方法1:实时荧光RT-PCR检测


实时荧光RT-PCR的特点是非常快速,其检测原理是针对要识别病毒的特异性核酸序列,设计特定的引物和探针。目前市场上的试剂盒大多都是识别RdRp基因,即围绕病毒核酸复制表达那一部分的基因设计探针。


在实时荧光RT-PCR的复制过程中,通过探针识别出病毒的这一部分序列,然后通过PCR将病毒的序列复制放大,在放大的过程中,在反应体系中加入染料,并实时捕获信号,最后通过qPCR附带的软件来计算Ct值,用于检测结果分析。


理论上这种方法非常灵敏,只要有一个病毒的核酸被识别出来,就都可以被放大,这个过程循环数越小,曲线提升越明显,意味着病毒的载量越高,所以是一种目的性非常强的特异性的方法。


方法2:病毒基因测序


如果说荧光RT-PCR方法像是在池塘里钓鱼,那么对样本进行宏基因组测序就类似于用一张大网将池塘中所有的鱼一网捞尽,把样本中人类的基因、病毒基因和其他微生物的基因都识别出来。


宏基因组测序方法检测更全面,敏感度高,特别是对于多重感染,如肺炎患者可能还同时感染甲型、乙型流感、支原体、鼻病毒等,也能通过宏基因组测序识别出来,但全流程时间比RT-PCR方法更长一些。此外,在病毒载量低于RT-PCR最低检出限及人源宿主背景较低的情况下,也可以通过高深度的测序来实现特异性的识别。


此外,还可以基于多重PCR靶向Panel的高通量测序方法获取SARS-CoV-2病毒全长基因组。这种方法可以在高通量测序的同时完成多个靶标的检测。


具体流程上,测序方法是在提取核酸之后,进行文库制备,随后进入测序仪测序得到序列信息,经过背景数据过滤后,将其比对到数据库上,从而获取病毒完整的reads,最后组装成完整的基因组序列。


图1  华大智造DNBSEQ-T7在1月3日完成新冠病毒全基因组序列组装


方法3:血清学检查


血清学检查方法,操作简单方便,最快15分钟内出结果。但试剂灵敏度和特异性还比较有限,适用于大量疑似病例和无症状感染者检测。因此目前我国在抗疫中广泛采用的是核酸检测。


荧光RT-PCR、高通量测序和血清学检查这三种方法各有侧重,不能相互替代。将多种检测方法联合应用,可有效缩短检测窗口期,提高阳性检出率。


盘点新冠病毒检测方案


围绕新冠病毒的实验室检测方法,下面我们从一站式、自动化和高通量等几个层面展开探讨。


荧光RT-PCR核酸检测与高通量测序这两种方法比较类似:实验室接收到样本之后,都要先对样本进行灭活处理,然后使用提取试剂盒提取出样本的核酸,根据不同的检测方式,RT-PCR会做反应体系的配置,而高通量测序则有文库制备的过程,接下来就进入各自的仪器,进行核酸序列的检测,随后系统会进行自动化的判定和结果输出。


其中,两种方法的样本提取、体系配置或建库等这些中间步骤的手工操作过程,都可以用自动化设备来完成,且更安全更快速。


图2  华大智造新冠病毒实验室产品方案



不同检测流程如何配置设备


那么具体到不同检测流程,如何配置实验室设备呢?以华大智造为例:


对于RT-PCR的检测方法,一台MGISP-960一小时处理96个样本核酸提取(目前已升级到80分钟处理192个样本),理论上一天8小时可以处理500-1000例样本;而常见荧光PCR仪以平均12小时处理700例样本估算,两台设备可采用1:1配置。同时华大智造也提供适配的试剂盒,包括核酸提取试剂盒以及荧光PCR体系配置的核酸检测试剂盒,可稳定实现至少每天500例的样本处理能力。


表1  RT-PCR核酸检测实验室设备,500-1000例样本/天


对于高通量测序(宏基因组)检测方法,该方法检测样本量的限制主要是基因测序仪。以目前华大智造通量最大的DNBSEQ-T7为例,1天可以处理最多128例样本(数据量>80M reads),因此上游可以配置4台MGISP-100或2台MGISP-960,完成从提取到建库的自动化流程,适配试剂盒可整套一起打包。


表2  高通量测序实验室设备,100-200例样本/天


对于高通量测序(靶向)检测方法,其原理是自动化提取+多重PCR靶向测序。不同于一网打尽的宏基因组测序,这种方法通过针对新冠病毒的特殊检测试剂盒,在测序前的样本制备中,先把新冠病毒的基因捞出来,然后再进行测序。这种方法兼具宏基因组测序和RT-PCR的优点,在得到病毒基因组全序列的同时,测序样本量可以提高10-20倍。


图3  华大智造新冠病毒检测试剂盒(多重PCR测序Panel)


在此基础上,通过内参还可以相对定量地判断病毒载量,更加适用于大量样本情况下的疫情检测和病毒变化的统计学分析研究。目前,华大智造已推出基于该方法的检测试剂盒(即多重PCR测序Panel)。