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用户测评 | 华大智造测序平台+国产WES Panel表现的均一性远超预期

时间:2021-08-12作者:华大智造阅读数:1358分享

对于靶向测序数据的评估,覆盖均一性是最为重要的参数之一,它决定了有多少目标区域能够达到分析要求,平均测序深度提高还不足以解决目标测序区域能够覆盖的问题,最终目标区域的覆盖情况还是取决于覆盖均一性


国产测序仪

均一性表现大大超出预期


通过华大智造DNBSEQ-T7测序平台上进行的大量测评工作,伯科生物科技有限公司(简称“伯科”)自主研发生产的全外显子Panel,TargetCap® Core Exome Panel v3.0,性能表现已经达到了国际一流产品标准,尤其是在覆盖均一性方面表现卓越。


华大智造DNBSEQ-T7基因测序仪


如图1所示,在测序5Gb的情况下,Core Exome Panel v3.0与DNBSEQ-T7测序平台的组合表现,≥20x的区域已经高达98.7%,大大超出了预期。


图1. TargetCap® Core Exome Panel v3.0在不同测序深度下的均一性表现


覆盖均一性决定了有多少目标区域能够达到分析要求。换言之,高均一性能够减少测序数据量,节约成本(图2A)。如图2B所示,伯科TargetCap® Core Exome Panel v3.0与MGISEQ-2000测序平台的组合表现出,当测序7.5Gb时(101X),≥20X以上的目标区域占比达到99.6%;当测序5Gb时(68X), ≥20X以上的目标区域占比仍然超过98%,远高于国标《GB/T 37872-2019》规定的80%


图2. 高均一性可有效节约测序数据量


此外,伯科为用户提供定制化基因Panel在华大智造测序平台上面表现如表1所示,对于不同大小的基因Panel,在0.2x平均深度方面,可以达到99.5%以上,在0.5x平均深度可以达到95%以上,Fold80可达1.4以下,总体上,定制基因Panel表现出极高的均一性


表1. 伯科定制化基因Panel在华大智造测序平台的性能表现



如此优秀的均一性

国产panel是怎么做到的?


通过伯科的研发团队发现,TargetCap® Core Exome Panel v3.0开发中确实有一些“黑科技“。


2.1 独创的局部探针浓度调整


在影响覆盖均一性的因素中,目标区域GC含量最为关键,通过对低/高GC区域的局部探针浓度调整可以优化Panel的覆盖偏好。但是,除了GC含量,还有一个鲜为人知的关键因素-探针补偿效应。伯科研发团队对引起覆盖偏好的因素进行聚类分析时发现,目标区域所覆盖的探针数量的多少,与其覆盖深度正相关,也就是说探针之间的侧翼补偿效应会引起覆盖偏好,其原理如图3所示。


图3. 探针侧翼补偿效应产生覆盖偏好示意图


按照目标区域覆盖探针数量的多少,我们把目标区域分为低、中、高补偿区(L-FLK、M-FLK和H-FLK),以及低、中、高GC区域分别对~1.5万条探针组成的Panel进行统计。


如图4所示,目标区域的覆盖深度与其探针数量正相关,也就是说,长短不一的目标区域会因覆盖探针的多少而产生天然的深度差异,其与GC偏好一样,是影响Panel覆盖的重要因素。


图4. GC含量和探针补偿效应对覆盖深度的影响


那么,调整L/M/H-FLK这3种区域的局部探针浓度,能否改善Panel的覆盖偏好呢?


为了验证这一假设,研发人员合成了L/M/H-FLK区域探针不同浓度配比的Panel,并进行捕获测序。


如图5所示,浓度配比2#的三个区域之间的覆盖差异最小,数据表现也最优,与比例1#相比,Fold 80降低0.1(SNP等位基因频率并未受到影响),证明探针补偿效应也是影响覆盖均一性的重要因素,调节补偿效应区域探针浓度是优化Panel均一性的有效手段。


图5. 调整不同探针补偿区的探针配比对覆盖均一性的影响


在此基础之上,再对GC偏好区域的探针局部浓度进行调整,也能使Fold80降低0.1,进一步表明探针补偿效应是独立于GC的覆盖偏好影响因子(图6)。


图6. 调整不同GC含量目标区域探针配比对覆盖均一性的影响


综上所述,针对覆盖偏好的关键影响因子探针补偿效应和GC含量,调整对应的探针浓度,可以明显改善Panel的覆盖均一性(图7)。


图7. 伯科生物自主研发的覆盖偏好优化技术原理示意图


2.2 自主知识产权的生物素修饰


在WES Panel的开发过程中,除了使用伯科独创的局部探针浓度调整技术,TargetCap® Core Exome Panel v3.0还采用伯科自主知识产权的专利生物素修饰。分别采用伯科自主知识产权的生物素与常规生物素分别制备Core Exome Panel v3.0,并进行捕获测序。


结果显示,与常规生物素相比,伯科自主知识产权的生物素能够进一步提升覆盖均一性(图8)。除此之外,通过加入多种小分子化合物,伯科自主研发的杂交试剂能够进一步降低GC偏好。


图8. 伯科生物素与常规生物素修饰的Core Exome Panel v3.0比较


综上所述,从杂交试剂、探针修饰/合成/设计、探针局部浓度调整等多方面测试优化调整,所谓“积跬步至千里“,每一步1%的提升积累,使得TargetCap® Core Exome Panel v3.0的覆盖均一性在众多竞品中脱颖而出。