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【智造微课】PCR-Free到底有啥“佛瑞”?
时间:2020-04-17作者:华大智造阅读数:827分享

在第二期智造微课中,PCR-Free技术在DNBSEQ平台的应用表现大放异彩。其中到底有何玄机,本文将做简单介绍。



为什么需要PCR-Free技术

在高通量测序中,之所以引入PCR方法,是为了对微量DNA样本进行扩增,提高文库产量,放大DNA荧光信号,提高测序准确度。但是PCR在带来一些好处的同时,也会带来一些问题。例如,PCR聚合酶有一定的比例会引入错误,然后通过PCR, 这些引入的错误会持续累积下来,造成假阳性的变异,难以区分和识别。此外,PCR聚合酶具有一定的扩增偏向性,一些区域,尤其是高GC或者低GC,二级结构等区域,扩增效率低,难以覆盖到;还会引入大量错误的InDel;同时带来大量的Duplication,造成DNA数据量的浪费,增加测序成本。


因此,我们需要PCR-Free技术:既能具备PCR的优势,也能克服PCR的缺点,能够带来高质量的文库,不仅具备高灵敏度、能够实现微量样本的检测,而且具备高准确性、能够减少后续变异研究的验证工作量。



PCR-Free技术原理

基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术,在建库和测序过程中均没有PCR错误,将无扩增错误的PCR-Free单链环状文库建库方法与无拷贝错误累积的DNB制备方法结合起来,可以全面覆盖基因组的复杂区域,检测更精准,能够有效避免PCR扩增引入的碱基错配和偏向性。基于该技术,华大智造现已推出MGIEasy™ PCR-Free文库制备试剂套装(物理打断法)和MGIEasy™ 酶切PCR-Free文库制备试剂套装(酶切法),样本兼容性好,支持自动化建库(适配华大智造MGISP系列自动化平台)。



PCR-Free技术优势

基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术,经过自主研发和升级优化,其整体优势可以概括为低投入,高产出


首先,在样本起始量方面,相较于其他平台PCR-Free方法的起始量要求,MGIEasy™ PCR-Free文库制备试剂套装(物理打断法)和MGIEasy™ 酶切PCR-Free文库制备试剂套装(酶切法)对起始量的要求都是最低的(50-1000ng之间),而且能够保证高质量的文库产出





其次,基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术具备低InDel假阳/假阴率,高准确度的优势:基于MGISEQ-2000平台的PCR-Free ,可以实现99.9%的SNP检测精度及99%的InDel检测准确性。




最后,基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术具备低深度,高灵敏度的优势:在4X、6X、8X、10X测序深度下,基于DNBSEQ平台SNP的灵敏度更高。



PCR-Free数据展示

以发表在bioRxiv的预印文章Advanced Whole Genome Sequencing Using a Complete PCR-free Massively Parallel Sequencing (MPS) Workflow为参考,通过对比PCR-Free基于不同测序平台的数据表现,结果显示:基于DNBSEQ 平台的MGIEasy™ PCR-Free数据相较于NovaSeq平台的MGIEasy™ PCR-Free数据及TruSeq™ DNA PCR-Free数据质量更优,尤其在Duplicate Rate以及InDel方面更具有显著优势





文章同时对比了在15X及30X测序深度下,PCR与PCR-Free基于不同测序平台的数据,结果显示基于DNBSEQ平台的 15X PCR-Free测序数据与30X PCR-Free的结果一致,这一对比说明:全基因组测序要求大量的数据,大部分是因为测序错误高、重复序列高、覆盖度不均一等问题需要数据量来进行修复,这就提高了测序的成本。而通过DNBSEQ平台的低深度PCR-free文库就可以达到其他平台高深度PCR文库相同水准的测序结果,从而大大降低了成本






PCR-Free应用方案

基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术,以其低投入、高产出的优势,在组学研究和临床应用的多个领域具有应用价值。


以群体基因组学研究为例,结合MGISP-960自动化建库仪以及DNBSEQ-T7测序仪,可以实现年通量一万人以上的高深度WGS检出。相较于其他方案,基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术对人群样本的起始量要求更低。



针对动植物基因组学研究,基于DNBSEQ平台的PCR-Free方法的突出优势是对高低GC物种,无扩增偏好性。除了人类样本,动植物中存在很多不同GC含量的物种,至少40%的物种的基因组GC含量偏高或者偏低,例如褐潮藻类和小球藻,GC含量高达65%以上;线虫等不到30%。对于这些GC含量偏高或者偏低的基因组,常规的PCR技术存在明显的扩增偏好性,难以很好地覆盖基因组。而PCR-Free方法可以让不同GC含量的物种均具有较好的基因组覆盖均一性。同时,如果选择在DNBSEQ-T7测序平台展开该方案的应用,则兼备超高通量的成本优势和时间优势















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