您现在的位置:首页 /  支持
基于DNBSEQ™平台的RNA测序
时间:2019-12-19作者:华大智造阅读数:1265分享

本期在线技术研讨会关注如何进行基于DNBSEQ™平台的RNA测序。具体解释了为什么我们要进行RNA测序,RNA的分类以及进行RNA测序的应用有哪些,RNA测序的全流程是什么?最后对华大智造的RNA类产品进行了相关的解释,对RNA产品的选择进行了指导等。

知识点1 :为什么要做RNA测序?

本期课程中,首先从中心法则开始,讲解RNA是从DNA转录而来,RNA测序也叫做转录组测序。通过对转录组进行研究,了解转录组的变化带来的生命现象的变化,才能从中发现生命最本质的变化。

回顾RNA进行研究的技术进展,从最开始的Northern 杂交,到RT-qPCR等等,直到2007年,基于高通量测序的DGE(Digital Gene Expression profiling数字基因表达谱)技术和2009年升级版的DGE RNAseq技术的出现,可以更高通量的检测基因的表达变化及聚类分析,并能发现一些新的基因。技术发展到这个阶段,RNA测序就成为了一项最基础的转录组研究利器。

知识点2:RNA的分类和相关应用

RNA的分类多种多样,在原核细胞中约80%是rRNA,序列比较保守,与核糖体结合参与mRNA的翻译过程,而真正编码蛋白的mRNA占比不超过5%。真核细胞中也是约80%是rRNA,15%是tRNA,剩下的5%除了mRNA,还有很多调控mRNA表达的非编码RNA,如lncRNA,circRNA和小RNA等。这5%就是我们RNA表达测序的主要研究对象,针对不同的研究对象有不同的建库测序技术。

在建库技术上,包括全转录组的测序,mRNA表达谱和转录组研究,小RNA测序以及一种特异的针对严重降解的FFPE类样本的建库测序技术,主要研究RNA的外显子区域。

知识点3:RNA的测序全流程

RNA富集方法:rRNA比例占比80%以上,且序列保守,如果全部RNA都进行测序会浪费大量数据,所以在文库构建前需先进行RNA的富集,一种是正向富集具有polyA尾巴的mRNA,一种是反向去除占比最高的rRNA进行全转录组测序。

RNA方向性建库,会在PCR之前加入UDG将二链cDNA剪断,那么就只有cDNA一链可进行PCR扩增。

Small RNA建库:由于片段太小,不能用常规的RNAseq建库流程。需要先在small RNA的3‘端加上3’接头,消化掉多余的3’接头后再连接5’接头,用带有barcode的反转录引物反转录后做PCR扩增,扩增后的产物需要富集纯化100-120bp范围内的small RNA片段,华大智造的small RNA建库试剂盒提供两种片段选择的方法,一种是磁珠纯化,一种是切胶纯化。

RNA exome:直接用总RNA构建RNA方向性文库,得到纯化的PCR产物后再用外显子探针将总RNA中的外显子区域捕获出来,捕获到的外显子区域再进行PCR扩增。

在每一种建库技术介绍的最后,课程中对每一个建库对应的数据量和推荐的读长进行了介绍。

知识点4:华大智造RNA类产品选择

根据上述的不同RNA测序的应用类型,华大智造都有相应的产品进行覆盖,课程中对每一个应用类型对应的建库试剂盒和测序试剂盒一一列出,且对每一个试剂盒的特性进行了介绍。

通过对RNA测序全面的学习,相信您已经建立关于RNA测序的总知识面,且对您自身进行RNA测序相关的实验设计打下牢固基础。

祝珍珍
祝珍珍
应用技术研发


如有任何相关问题,可以发送邮件至:
MGI_info@genomics.cn